根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)，在10月8日-10月10日3天時(shí)間里，全球COVID-19新確診患者數(shù)目就增加了100萬(wàn)人。隨著北半球秋冬季的到來(lái)，控制COVID-19疫情仍然面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)?？焖?、準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)能夠幫助醫(yī)務(wù)工作者更早發(fā)現(xiàn)受到新冠病毒感染的患者，從而對(duì)他們進(jìn)行治療/隔離和接觸者追蹤。目前的大部分核酸檢測(cè)仍然需要將樣本送到專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理，往往需要一天，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能獲得結(jié)果，從而可能延誤對(duì)患者進(jìn)行治療和隔離的時(shí)間。

因此，科研人員一致在努力開(kāi)發(fā)更快速、更簡(jiǎn)便的核酸檢測(cè)。使用CRISPR技術(shù)加快檢測(cè)速度是其中的一個(gè)方向。藥明康德內(nèi)容團(tuán)隊(duì)此前也報(bào)道過(guò)著名學(xué)者張鋒博士率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)和他的合作者們利用CRISPR技術(shù)開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)易新冠病毒檢測(cè)的努力。為了讓檢測(cè)更為快速、簡(jiǎn)便，張鋒團(tuán)隊(duì)的STOPCovid檢測(cè)已經(jīng)經(jīng)過(guò)不斷迭代，不但使用恒溫PCR代替了傳統(tǒng)PCR，而且刪減了純化RNA的過(guò)程，還通過(guò)優(yōu)化步驟提高了檢測(cè)的靈敏度。

日前，今年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主之一Jennifer Doudna博士率領(lǐng)的團(tuán)隊(duì)和她的合作伙伴在預(yù)印本網(wǎng)站medRxiv上發(fā)布了一篇論文，基于CRISPR-Cas13a技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種新型新冠病毒檢測(cè)。這款檢測(cè)與眾不同之處在于它不需要對(duì)病毒RNA使用RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，可以直接定量檢測(cè)樣本中的病毒RNA水平。研究人員還開(kāi)發(fā)了一款基于智能手機(jī)相機(jī)的檢測(cè)系統(tǒng)，讓醫(yī)務(wù)人員不需要復(fù)雜的儀器，就可以在實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境中讀出檢測(cè)結(jié)果。

不用PCR，提高CRISPR檢測(cè)的靈敏度

這一檢測(cè)的核心原理并不難理解。研究人員使用一種叫做Cas13a的酶和與之相結(jié)合的CRISPR RNA（crRNA）構(gòu)成一個(gè)復(fù)合體。當(dāng)crRNA與病毒RNA上的特異性序列相結(jié)合之后，能夠激活Cas13a酶。Cas13a是一種很有趣的酶，一旦被激活，它就會(huì)不分青紅皂白地切開(kāi)周?chē)龅降娜魏纹渌麊捂淩NA分子。利用這種特性，研究人員們?cè)跇颖纠镞€會(huì)添加一種通過(guò)RNA相連接的熒光分子。一旦Cas13a得到激活，這種特殊分子上的RNA就會(huì)被切斷，釋放出能夠發(fā)出熒光的熒光分子。這樣通過(guò)讀取熒光信號(hào)，就可以檢測(cè)到病毒特異性序列的存在。

以前基于這一原理的CRISPR檢測(cè)為了提高檢測(cè)的靈敏度，都要對(duì)樣本中的RNA通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。然而這一PCR步驟不但增加了檢測(cè)所需的時(shí)間，也意味著檢測(cè)數(shù)量會(huì)受到PCR試劑供給的限制。

▲使用多個(gè)靶向不同病毒序列的crRNA能夠提高檢測(cè)靈敏度（圖片來(lái)源：參考資料[2]）

在這項(xiàng)研究中，研究人員采用了另一種方法提高檢測(cè)的靈敏度。他們推測(cè)，既然一個(gè)跟病毒特異性序列結(jié)合的crRNA能夠激活Cas13a酶的活性，那么兩個(gè)跟不同病毒特異性序列結(jié)合的crRNA是否就能更快地激活Cas13a酶的活性，讓熒光信號(hào)的上升速度變得更快呢？

實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了他們的假設(shè)。當(dāng)研究人員使用兩種不同的crRNA激活Cas13a酶時(shí)，雖然總共的crRNA水平?jīng)]有變，但是熒光信號(hào)的增長(zhǎng)速度明顯提高了。通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的增長(zhǎng)速度而不是熒光信號(hào)的絕對(duì)值，他們發(fā)現(xiàn)使用兩個(gè)crRNA能夠顯著提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)使用一個(gè)crRNA時(shí)，檢測(cè)的靈敏度達(dá)到10，000個(gè)病毒拷貝/微升，而使用兩個(gè)不同crRNA時(shí)，靈敏度提高到低于1000拷貝/微升。

為了進(jìn)一步提高檢測(cè)的靈敏度，研究人員開(kāi)發(fā)了包含3個(gè)靶向新冠病毒不同特異性RNA序列的crRNA的檢測(cè)手段，在檢測(cè)5個(gè)COVID-19患者鼻咽拭子樣本的實(shí)驗(yàn)中，這一檢測(cè)準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)了這5個(gè)陽(yáng)性樣本，而且熒光信號(hào)增加的速度與輸入樣本中的病毒拷貝數(shù)有很好的線性關(guān)系，進(jìn)一步證明這一檢測(cè)可以用于定量測(cè)量病毒水平。

利用智能手機(jī)的相機(jī)構(gòu)建簡(jiǎn)易信號(hào)讀取系統(tǒng)

為了證明這一簡(jiǎn)易檢測(cè)能夠在實(shí)驗(yàn)室以外的環(huán)境中使用，研究人員基于智能手機(jī)的相機(jī)構(gòu)建了一個(gè)簡(jiǎn)易的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)。令他們意外的是，這個(gè)基于手機(jī)相機(jī)的熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度竟然比實(shí)驗(yàn)室里使用的商業(yè)化讀板器（plate reader）高出一個(gè)數(shù)量級(jí)。使用這款簡(jiǎn)易熒光信號(hào)檢測(cè)系統(tǒng)，研究人員只需5分鐘就能判斷出5位COVID-19患者的鼻咽拭子樣本為陽(yáng)性。

▲基于智能手機(jī)相機(jī)設(shè)計(jì)的熒光信號(hào)讀取系統(tǒng)（圖片來(lái)源：參考資料[2]）

研究人員在討論部分指出，如今智能手機(jī)不但很普及，而且它們的相機(jī)靈敏度都很高。更重要的是智能手機(jī)通常都攜帶GPS并且可以聯(lián)網(wǎng)。這讓將讀取的結(jié)果傳輸?shù)皆贫藬?shù)據(jù)庫(kù)，協(xié)助接觸者追蹤變得更為簡(jiǎn)便。基于智能手機(jī)的新冠病毒檢測(cè)系統(tǒng)可能在控制目前和未來(lái)的大流行方面起到重要的作用。

參考資料：

[1] New test detects coronavirus in just 5 minutes. Retrieved October 12, 2020, from https://www.sciencemag.org/news/2020/10/new-test-detects-coronavirus-just-5-minutes

[2] Fozouni et al., Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone. medRxiv, doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947