今年國慶第一天，當我們正沉浸在節(jié)日的歡愉中時，瑞典卡羅琳斯卡醫(yī)學院在斯德哥爾摩宣布，將2018年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎授予美國科學家詹姆斯·艾利森和日本科學家庶佑，以表彰他們發(fā)現(xiàn)了抑制免疫負調節(jié)的癌癥療法——“免疫檢查點療法”。這消息確實讓人振奮，不僅僅是因為免疫療法現(xiàn)在已經是國內外研究熱點，更是因為它的出現(xiàn)將抗癌史推向一個新的里程碑。

我們都知道，T細胞平時處于免疫監(jiān)視狀態(tài)，僅在它們受到活化時才能發(fā)揮作用。T細胞的完全活化依靠“雙信號”系統(tǒng)調控：第一種信號來自其TCR（T細胞受體）與抗原肽-MHC（主要組織相容性復合體）復合物的特異性結合，即T細胞對抗原識別；第二種信號來自協(xié)同刺激分子，即抗原遞呈細胞（APC）表達的協(xié)同刺激分子與T細胞表面的相應受體或配體相互作用介導的信號，如CD28/B7是重要的正性共刺激分子（positive costimulatory molecule）。此外，為了避免T細胞不被過度刺激，還有調節(jié)T細胞的負性共刺激分子（negative costimulatory molecule），主要有CTLA4-B7通路和PD-1/PD-L1通路。

圖1. T細胞表面的主要刺激性和抑制性受體

免疫檢查點是指免疫系統(tǒng)中存在的一些抑制性信號通路，比如PD-1/PD-L1 通路和CTLA-4通路。在正常情況下，為了防止活化的T細胞攻擊正常的人體細胞，免疫系統(tǒng)能夠通過免疫檢查點控制T細胞的活化進程，調節(jié)自身免疫反應的強度來維持免疫耐受，從而防止出現(xiàn)T細胞誤傷的情況。對于人體來說，這是一種正常的程序，然而腫瘤細胞通過竊取這種程序，激活免疫檢查點來抑制T細胞的免疫活性，從而有利于腫瘤細胞的免疫逃逸和生長。

在發(fā)現(xiàn)了這一原理之后，科學家們就希望通過阻斷抑制性信號通路來殺滅癌細胞。美國德克薩斯大學的詹姆斯·艾利森（James P. Allison）教授和日本京都大學的本庶佑（Tasuku Honjo）教授因分別在CTLA-4通路和PD-1/PD-L1 通路上作出卓越貢獻而榮獲2018年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。T細胞表面受體蛋白CTLA-4和PD-1起著T細胞制動器或者說免疫系統(tǒng)“分子剎車”的作用。如果能夠暫時抑制T細胞表面表達的CTLA-4或PD-1的活性，就能提高免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊性，從而殺傷腫瘤。這就為癌癥治療開創(chuàng)了全新的免疫治療思路——通過免疫檢查點抑制劑阻斷CTLA-4或PD-1等免疫檢查點進而釋放免疫系統(tǒng)自身的能力來攻擊腫瘤。

目前研究和應用最廣泛的免疫檢查點抑制劑包括CTLA-4、PD-1 以及其配體PD-L1 的抑制劑。免疫檢查點抑制劑治療通過抑制免疫檢查點活性，釋放腫瘤微環(huán)境中的免疫剎車，重新激活T細胞對腫瘤的免疫應答效應，從而達到抗腫瘤的效果。

1. PD-1/PD-L1/PD-L2

PD-1，即程序性死亡受體1（programmed death 1，又稱CD279），是1992年本庶佑教授首次發(fā)現(xiàn)的。他從小鼠淋巴細胞中分離和鑒定出PD-1基因并獲得了小鼠PD-1蛋白，并公布了小鼠PD-1蛋白的序列，當時他認為PD-1的活化會導致T細胞凋亡，這也是PD-1名字的由來。1994年，他獲得了人類PD-1基因和蛋白，并在1999年首先提出PD-1是一個免疫系統(tǒng)的負調控因子。2000年10月，他與達納-法伯癌癥研究所的Gordon Freeman發(fā)現(xiàn)了屬于B7蛋白家族的PD-L1蛋白是PD-1的配體，還首次證實了PD-L1通過結合PD-1，抑制了T細胞的增殖和分泌細胞因子等功能。

PD-1是一種重要的免疫抑制分子，屬于CD28超家族成員，是由PDCD1基因編碼的跨膜蛋白。PD-1是一種誘導表達的蛋白，即T細胞在未活化的時候幾乎不表達PD-1，僅在T細胞活化之后，它們才會誘導表達PD-1。除了在活化的T細胞上表達之外，PD-1還表達于活化的B細胞、自然殺傷細胞（NK細胞）、單核細胞以及部分腫瘤細胞。

圖2. PD-1的結構示意圖

PD-1是由268個氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白。它的結構主要包括胞外免疫球蛋白可變區(qū)（Ig V）樣結構域、疏水的跨膜區(qū)和胞內區(qū)。胞內區(qū)尾部含有2個獨立的磷酸化作用位點，分別為免疫受體酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine based inhibitory motif, ITIM）和免疫受體酪氨酸轉換基序（immunoreceptor tyrosine based switch motif，ITSM）。PD-1胞外IgV樣結構與其配體結合后，促使PD-1 的ITSM結構域中的酪氨酸發(fā)生磷酸化，進而引起下游蛋白激酶Syk和PI3K的去磷酸化，抑制下游AKT、ERK等通路的活化，最終抑制T細胞活化所需基因及細胞因子的轉錄和翻譯，發(fā)揮負向調控T細胞活性的作用。

PD-1的天然配體有兩個，分別為PD-L1和PD-L2。PD-L1（Programmed death ligand 1，又稱CD274，B7-H1）華人科學家陳列平教授首次發(fā)現(xiàn)的。1999年12月，他首先發(fā)表了PD-L1的基因及蛋白序列，他以B7H1稱呼PD-L1蛋白。遺憾的是，陳列平沒有發(fā)現(xiàn)B7H1就是PD-1的配體，而且認為B7H1是T細胞的一種新的共刺激分子，這和后來多數(shù)人的認知略有不同。這可能就是讓他與今年的諾貝爾獎插身而過的原因。陳列平比Freeman早10個月公布了PD-L1的序列。Freeman的相關專利于1999年8月提交，比陳列平早3個月，在這個專利中Freeman也公布了PD-L1的序列，可以認為陳列平和Freeman幾乎同時發(fā)現(xiàn)了PD-L1蛋白。后來陳列平于2002年發(fā)表文章，指出大多數(shù)腫瘤細胞通過表達PD-L1實現(xiàn)免疫逃逸，這為開發(fā)PD-1/PD-L1藥物用于癌癥治療提供了重要理論依據(jù)。

PD-L1是一種40kD的跨膜蛋白，由CD274基因編碼，誘導表達于T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間充質干細胞、骨髓來源的肥大細胞和非造血細胞的表面上，在干擾素及其他炎癥因子刺激應答的腫瘤組織和其他組織中都可能會迅速上調。PD-1/PD-L1通路激活后，在癌癥、妊娠、組織移植以及自身免疫病中抑制免疫系統(tǒng)。此外，PD-L1還能與CD80結合，競爭性抑制CD80與配體結合的T細胞激活通路，成為PD-L1抑制T細胞活性的另一機制。

圖3. PD-1/PD-L1信號通路介導的腫瘤特異性T細胞功能抑制

PD-L2(Programmed death ligand 2，又稱CD273，B7-DC)表達范圍較窄，主要在活化的巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞中表達上調。PD-L1與PD-L2有37%的同源序列，但由于主要表達載體的不同，導致調節(jié)作用是不同的。PD-L1不同于PD-L2，表達在多種腫瘤細胞中，使PD-L1成為研究PD-1/PD-L通路在腫瘤免疫治療領域中的主要配體。通過對PD-1/PD-L結合親和力的研究，表明PD-L2對PD-1的親和力是PD-L1的3～4倍，因此，PD-L1/PD-1解離率相當于PD-L2/PD-1解離率的3倍。值得注意的是，PD-1/PD-L通路相互作用要比T細胞上其他抑制性蛋白弱且弱許多，如CTLA-4/B7-1，且PD-1/PD-L復合物半衰期可能是CTLA-4/B7-1復合物的1/1000-1/5000。這也是PD-1/PD-L通路能成為一個很好的免疫治療靶點的重要原因。PD-L1對T細胞功能的影響主要依賴于TCR和CD28信號的強度。

腫瘤細胞主要通過以下途徑上調PD-L1表達：（1）EGFR、MAPK或PI3K-Akt通路的激活，STAT3蛋白高表達和HIF-1轉錄因子等均可以上調PD-L1的表達；（2）編碼PD-L1的基因擴增（9p24.1）；（3）EB病毒的誘導（EB病毒陽性的胃癌和鼻咽癌，沒有9p24.1基因擴增，也可以表現(xiàn)為PD-L1的高表達）；（4）表觀遺傳學機制；（5）在腫瘤微環(huán)境中，炎癥因子（特別是Υ-干擾素）的刺激同樣可以誘導腫瘤細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和基質細胞等表達PD-L1和PD-L2，而能夠識別腫瘤抗原的活化腫瘤浸潤性T細胞是Υ-干擾素的重要產生者，這一過程被稱為“適應性免疫抵抗”，通過這一機制，腫瘤細胞實現(xiàn)自我保護；（6）2018年8月，Gang Chen等人發(fā)現(xiàn)在轉移性黑色素瘤、乳腺癌和肺癌等癌癥中，癌細胞釋放攜帶著PD-L1的外泌體，外泌體PD-L1可直接結合T細胞并抑制這些T細胞的功能。

2.抗PD-1/PD-L1單抗藥物開發(fā)以及專利壁壘

在發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1通路對T細胞有負調控作用后，當時科學家們普遍認為這條通路可能用于自身免疫疾病藥物的開發(fā)。2001年6月和7月，本庶佑與小野制藥(Ono Pharmaceutical)一起在日本先后提交了兩件專利申請，并以這兩件日本專利申請作為在先申請?zhí)峤涣艘豁棙祟}兩件國際專利申請（申請?zhí)枺篧O2004072286A1和WO03011911A1），要求保護的內容實質上就是任何物質，只要特異性與人PD-1蛋白結合，都會侵犯了本庶佑和小野制藥的專利，不過沒有列出證據(jù)證實阻斷PD-1可以用作免疫療法。他們要求保護的范圍如此之大是特別嚇人的。但是，根據(jù)他們最終在日本、美國和歐洲獲得的專利權，他們實際上得到的保護范圍是一種同時結合人PD-1和CD3的雙特異性抗體，特別涉及結合人PD-1的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，以及結合人CD3的重鏈可變區(qū)序列和輕鏈可變區(qū)序列，這個保護范圍相對而言要小很多。

圖4.PD-1/PD-L1抑制劑作用機制

在美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）最早批準兩個抗PD-1單抗藥物---派姆單抗（pembrolizumab, 也譯作帕博利珠單抗，商品名Keytruda）和納武單抗（nivolumab，商品名為Opdivo）中，派姆單抗因為治愈了美國前總統(tǒng)卡特的肝腦轉移性皮膚癌，而名聲大振，被民間稱為治愈總統(tǒng)的抗體。

1.1派姆單抗上位的曲折歷史

派姆單抗的研發(fā)始于2006年，是加入荷蘭Organo公司的科學家Gregory Carven，Hans van Eenennaam和John Dulos發(fā)明的。2007年先靈葆雅公司（Schering-Plough）收購了Organo公司, 該產品當時處于臨床前期階段。2009年10月，默沙東公司（Merck & Co）收購了先靈葆雅公司后，并對先靈葆雅公司的研發(fā)產品逐一進行了評估，對派姆單抗并不看好。2012年6月初美國臨床腫瘤年會上，百時美施貴寶公司（Bristol-Myers Squibb）報道了PD-1抗體納武單抗治療晚期黑色素瘤和肺癌的成功經驗。這促使默沙東公司將寶押在派姆單抗上。

2013年美國臨床腫瘤年會上，默沙東公司和百時美施貴寶公司分別報道了PD-1抗體派姆單抗和納武單抗治療皮膚癌，肺癌和腎癌的臨床進展，結果表明它們具有廣譜抗癌效應，這是因為它們并不作用于癌細胞，而是作用于T細胞膜上的PD-1。一旦阻斷這種受體與癌細胞表面配體PD-L1的結合，就解除了癌細胞對T細胞的抑制，這樣T細胞就能夠有效地殺滅癌細胞。這種治療觀念上的突破，不僅為癌癥患者帶來了福音，也為免疫治療本身帶來了益處，也因此癌癥免疫治療被《Science》期刊評為2013年年度十大科學突破之首。

1.2納武單抗上位的曲折歷史

2001年初，美國美達瑞（Medarex）生物公司在開發(fā)CTLA-4抗體產品方面已進入后期。作為一家小型公司，美達瑞公司接下來選中了PD-1/PD-L1作為新靶點開發(fā)腫瘤免疫藥物，這是因為PD-1和CTLA-4同屬一個蛋白家族，開發(fā)同類產品對或許能降低系統(tǒng)性風險；PD-1/PD-L1通路與體內免疫調節(jié)有關系，但副作用可能較低；PD-1/PD-L1通路是一個負調控因子只存在于已活化的T細胞里，正常的T細胞不表達PD-1，毒性相對較小。為此，美達瑞公司的開發(fā)團隊（包括華人王常玉）通過重組表達PD-1、PD-L1和PD-L2蛋白，同時借助于人源化小鼠抗體平臺，通過篩選獲得產生PD-1抗體的雜交瘤細胞株。在測序獲得PD-1抗體的可變區(qū)序列后，美達瑞公司的開發(fā)團隊將PD-1抗體的可變區(qū)與IgG4的恒定區(qū)融合在一起，同時將IgG4恒定區(qū)的228位點絲氨酸替換成脯氨酸，解決了天然IgG4抗體在體內的不穩(wěn)定性問題。這樣就得到了納武單抗。

2003年2月，本庶佑和小野制藥的國家專利申請WO03011911A1公布了，美達瑞公司意識到自己的PD-1抗體可能繞不開這個專利，作為早期研發(fā)型公司也需要合作伙伴分攤高昂的臨床開發(fā)費用，雙方于2005年5月13日宣布達成合作協(xié)議，明確提到使用小野制藥的PD-1專利和美達瑞公司的抗體開發(fā)平臺以共同開發(fā)PD-1抗體。根據(jù)雙方的協(xié)議，小野制藥獲得了PD-1抗體除北美以外的全球權益，而美達瑞公司保留了PD-1抗體在北美的商業(yè)權益。

2004年前后，美達瑞公司一方面和小野制藥展開談判，一方面也在構建自己的專利保護壁壘，趕在雙方達成協(xié)議前的2005年5月9日，提交了多份和PD-1相關的專利：Methods for treating cancer using anti-pd-1 antibodies（11）、Human Monoclonal Antibodies To Programmed Death 1(PD-1) And Methods For Treating Cancer Using Anti-PD-1 Antibodies Alone or in Combination with Other Immunotherapeutics（12）、Methods for treating cancer using anti-PD-1 antibodies in combination with anti-CTLA-4 antibodies（13）等等。

有理由相信，本庶佑和小野制藥并未重視PD-1單抗的臨床價值。2011年，收購了美達瑞公司的百時美施貴寶公司，沒花什么代價就從小野制藥換回了PD-1抗體在歐洲和中國的商業(yè)權益。百時美施貴寶公司通過收購美達瑞公司獲得的PD-1抗體納武單抗，以商品名Opdivo的名字于2014年6月在日本獲得批準用于治療黑色素瘤，成為全球第一個被批準的PD-1藥物，隨后于2014年12月在美國獲得批準，2015年3月以創(chuàng)紀錄的速度在申報后四天內得到美國FDA批準，用于治療鉑化療后依然進展的轉移性鱗狀非小細胞肺癌。

1.3 PD-1/PD-L1領域專利壁壘

2014年9月4日，在默沙東公司的PD-1單抗派姆單抗獲得美國FDA批準的當夜，百時美施貴寶公司向默沙東公司提起了訴訟，稱默沙東的派姆單抗侵犯了百時美施貴寶/小野制藥公司關于PD-1抗體用于治療癌癥的系列專利。

2017年1月20日，百時美施貴寶/小野制藥公司宣布和默沙東就PD-1單抗的專利訴訟簽署了一項和解及全球專利許可協(xié)議（14）：默沙東要向百時美施貴寶/小野制藥公司支付6.25億美元的首付款，以及在2017～2023年間派姆單抗銷售額的6.5%，2024～2026年間派姆單抗銷售額的2.4%，百時美施貴寶公司和小野制藥公司將按75/25的比例分成。

從PD-1抗體專利技術布局來看，抗體專利申請量最多，其次是抗受體、抗腫瘤藥、DNA重組技術、受體表面抗原等。從權利人來看，專利最多的公司是日本小野制藥和達納法伯癌癥研究機構（Dana-Farber Cancer Institute）。從PD-1抗體專利市場布局來看，美國是各大藥企最重要的市場，各申請人在美國共布局了156件專利，基本覆蓋全部技術類別；歐洲、日本和中國也是各大藥企競相追逐的市場；此外，奧地利、阿根廷、秘魯、波蘭等國均有專利布局。

1.4.已上市的6種PD-1/PD-L1單抗藥物

綜上所述，雖然早在1992年本庶佑教授就發(fā)現(xiàn)了PD-1，但是一直到2014年，派姆單抗和納武單抗才被FDA正式批準為治療黑色素瘤的藥物。從發(fā)現(xiàn)PD-1到PD-1抗體抑制劑的臨床應用，花了22年的時間。PD-1/PD-L1抑制劑是免疫檢查點單抗藥物，是近年來腫瘤免疫療法研究的熱點。已上市的納武單抗和派姆單抗屬于PD-1抑制劑，主要用于黑素瘤和非小細胞肺癌的治療，對腎細胞癌、膀胱癌、霍奇金淋巴瘤等的療效還在大規(guī)模臨床試驗中。PD-L1抑制劑阿替珠單抗（atezolizumab，商品為Tecentriq）、度伐單抗（durvalumab，商品名為Imfinzi）和阿維單抗（avelumab，商品名Bavencio）已被批準用于治療尿道上皮癌，還有其他幾種藥物尚處于早期臨床試驗階段。2018年9月28日，F(xiàn)DA批準了由賽諾菲（Sanofi）和再生元（Regeneron）聯(lián)合研發(fā)的Libtayo（cemiplimab-rwlc）上市，用于治療轉移性皮膚鱗狀細胞癌（CSCC）或不能接受治愈性手術或放療的局部晚期CSCC患者。這也是由FDA批準獲批上市的第3款抗PD-1抗體。

自2014年上市開始，PD-1/PD-L1抑制劑就以超級黑馬的姿態(tài)橫掃各種腫瘤會議，也陸續(xù)獲批了多種腫瘤適應癥。截至目前，作為全球藥物審批最嚴格的機構之一，F(xiàn)DA就已經批準了6種PD-1/PD-L1抑制劑用于多種不同類型腫瘤的治療，三種抗PD-1抗體和三種抗PD-L1抗體，其中納武單抗的基本適應癥包括：（1）轉移性黑色素瘤（單藥使用或者與CTLA-4抗體藥物易普利姆瑪聯(lián)合使用后的單藥維持）；（2）抗血管生成治療后的晚期腎細胞癌；（3）在含鉑類化療中或化療后進展的局部晚期或轉移性尿路上皮癌；（4）自體造血干細胞移植后復發(fā)或進展的，和塞瑞替尼或三線/多線系統(tǒng)治療后復發(fā)進展的霍奇金淋巴瘤；（5）鉑類治療后復發(fā)或轉移的頭頸部鱗癌；（6）索拉非尼治療后的肝細胞癌；（7）根治性切除伴淋巴侵犯和轉移的患者的輔助治療；（8）非小細胞肺癌；（9）存在高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI-H）或錯配修復缺陷（dMMR）的轉移性結直腸癌。

派姆單抗的適應癥包括：黑色素瘤、非小細胞肺癌、霍奇金淋巴瘤、頭頸部鱗癌、膀胱癌、MSI-H或dMMR實體瘤以及胃癌等。納武單抗和派姆單抗存在的常見不良反應為皮疹、疲乏、呼吸困難、肌肉骨骼痛、食欲減退、咳嗽、惡心、嘔吐、便秘等。

羅氏開發(fā)的PD-L1抑制劑阿替珠單抗的適應癥包括：用于治療膀胱癌、接受含鉑化療治療期間或治療后病情進展的非小細胞肺癌、接受靶向療法（若腫瘤中存在EGFR或ALK基因異常）治療失敗的轉移性非小細胞肺癌，以及無法進行常規(guī)順鉑化療的局部晚期或轉移性尿路上皮癌。阿斯利康開發(fā)的度伐單抗的適應癥包括：局部晚期或轉移性尿路上皮癌、晚期膀胱癌，以及接受鉑類放化療后，疾病尚未進展的不可手術切除的局部晚期非小細胞肺癌。輝瑞/默克聯(lián)合開發(fā)的阿維單抗是一種人IgG1 λ單克隆抗體，它的適應癥包括：12歲以上的轉移性梅克爾細胞癌，以及鉑類化療期間或化療后病情進展的局部晚期或轉移性尿路上皮癌。

4.問題與展望

據(jù)不完全統(tǒng)計，目前全球有超過800個臨床試驗在探索PD-1/PD-L1抑制劑的抗腫瘤效果，這充分說明了PD-1/PD-L1抑制劑的受認可程度。因此，這才有了將PD-1/PD-L1抑制劑奉為“神藥”的說法。

不過，雖然PD-1/PD-L1抑制劑在腫瘤治療中一路開疆拓土，喜報接踵而至，適應癥不斷增加，為眾多腫瘤患者帶來了新的希望。但應該清醒的認識到，目前，實際上只有約20%～40%的患者能夠從這一昂貴的治療方法中獲益。在已經批準的PD-1/PD-L1抑制劑適應癥中，也只有符合一定條件的患者才可能從治療中獲益。

我國肺癌患者中，具有EGFR敏感突變的患者比例較高，因此可接受靶向治療的患者較多。然而，在這部分患者中，目前尚無證據(jù)顯示PD-1/PD-L1抑制劑比靶向治療更好。同時，現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)提示，EGFR敏感突變的患者，靶向治療耐藥后，PD-1/PD-L1抑制劑與化療相比，仍無優(yōu)勢。

身處精準醫(yī)學的時代，PD-1/PD-L1抑制劑一經問世就開始努力借鑒靶向治療的成功之路。但遺憾的是，目前的PD-L1表達、腫瘤突變負荷、腫瘤新抗原、MSI-H/dMMR等檢測，還無法達到靶向治療的精準程度。PD-1/PD-L1抑制劑的精準治療，依然任重道遠。此外，即使對PD-1/PD-L1抑制劑有效的患者中，接受一段時間治療后，絕大多數(shù)還是會不可避免的發(fā)生耐藥。近期，PD-1/PD-L1抑制劑相關的MYSTIC、IMvigor211等幾項臨床試驗未能繼續(xù)所向披靡，而是均嘗敗績。這再次說明，PD-1/PD-L1抑制劑并非“萬能神藥”。知名腫瘤學期刊Lancet Oncology也呼吁，對PD-1/PD-L1抑制劑應回歸理性。

盡管PD-1/PD-L1抑制劑，是人類在“抗癌之戰(zhàn)”中新的有效武器，為廣大腫瘤患者帶來了新的希望，PD-1/PD-L1抑制劑并不能徹底解決腫瘤之患。需要探索如何與手術、介入治療、化療、放療、靶向治療等多種“武器”聯(lián)合發(fā)揮作用，從而不斷提高腫瘤的治療效果。

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