近日，頂尖學(xué)術(shù)期刊《科學(xué)》推出了“變革生物學(xué)的技術(shù)”特刊，為我們?cè)敿?xì)介紹了數(shù)種目前正在給生物學(xué)領(lǐng)域帶來(lái)革新的重磅技術(shù)。在今天的這篇文章里，藥明康德微信團(tuán)隊(duì)為各位讀者朋友們整理了其中關(guān)于CRISPR/Cas的內(nèi)容，一道展望它能如何指引基因工程的未來(lái)。

CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的多樣性、模塊性和高效性正在掀起一場(chǎng)生物技術(shù)革命。RNA指導(dǎo)的Cas酶已經(jīng)被用來(lái)作為在培養(yǎng)細(xì)胞，動(dòng)物和植物中操縱基因組的工具。它不但加快了基礎(chǔ)研究的步伐，而且讓臨床和農(nóng)業(yè)突破成為可能。日前，CRISPR-Cas基因編輯系統(tǒng)的鼻祖之一，加州大學(xué)伯克利分校的Jennifer A. Dounda博士和她課題組的Gavin J. Knott博士在《科學(xué)》雜志上撰文，對(duì)這一技術(shù)的優(yōu)勢(shì)、進(jìn)化趨勢(shì)和應(yīng)用進(jìn)行了盤點(diǎn)。

Jennifer A. Dounda博士（圖片來(lái)源：加州大學(xué)伯克利官網(wǎng)）

從微生物的免疫系統(tǒng)到可編程的基因組編輯工具

CRISPR-Cas系統(tǒng)是微生物體內(nèi)的一種RNA指導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。它利用RNA來(lái)引導(dǎo)核酸酶與特定核酸序列相結(jié)合并且將它們切斷。當(dāng)病毒入侵細(xì)菌時(shí)，細(xì)菌能夠捕捉到外來(lái)遺傳物質(zhì)的片段并且將它們整合到自身基因組中的CRISPR序列中。CRISPR序列轉(zhuǎn)錄生成的CRISPR RNA（crRNA）能夠與Cas核酸酶相結(jié)合，通過(guò)與靶點(diǎn)核酸序列進(jìn)行堿基配對(duì)為Cas核酸酶提供結(jié)合特異性。Cas核酸酶和crRNA結(jié)合之后，能夠在細(xì)菌體內(nèi)起到監(jiān)控病毒入侵的作用，當(dāng)與crRNA匹配的遺傳片段再度出現(xiàn)時(shí)，Cas核酸酶能夠切斷這些遺傳片段，從而提供免疫保護(hù)作用。

CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)（圖片來(lái)源：《科學(xué)》）

在眾多天然CRISPR-Cas系統(tǒng)中，2類（class 2）系統(tǒng)只需要一個(gè)RNA指導(dǎo)的Cas核酸酶就能夠完成對(duì)靶點(diǎn)的切割。其中Cas9核酸酶成為了第一個(gè)被用于基因組編輯的Cas效應(yīng)子。Cas9有諸多特點(diǎn)讓它能夠進(jìn)行準(zhǔn)確而有效的編輯。Cas9通過(guò)特異性識(shí)別crRNA和它與反式激活crRNA（tracrRNA）之間的相互作用保證Cas9只和對(duì)應(yīng)的指導(dǎo)RNA相結(jié)合。而crRNA和tracrRNA可以被融合成一個(gè)指導(dǎo)RNA（sgRNA）。最后，Cas9需要與特定PAM序列旁邊的DNA片段相結(jié)合才能觸發(fā)Cas9的雙鏈DNA切割功能。世界各地的科學(xué)家們選擇Cas9作為基因編輯工具的原因正是因?yàn)檫@種核酸酶的可控性和通過(guò)修改sgRNA靶點(diǎn)就能改變Cas9切割位點(diǎn)的便捷性。

雖然Cas9仍然是最常用的Cas效應(yīng)子，但是科學(xué)家們已經(jīng)將Cas效應(yīng)子的范圍擴(kuò)展到其它類型的Cas蛋白中去。CRISPR-Cas12a能夠靶向DNA序列，而CRISPR-Cas13a能夠靶向RNA。這些由RNA指導(dǎo)的核酸酶系統(tǒng)的可編程（programmability）特點(diǎn)是CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠在精準(zhǔn)基因組編輯以外獲得廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。

2類CRISPR-Cas系統(tǒng)（圖片來(lái)源：《科學(xué)》）

Cas媒介的基因組編輯的應(yīng)用

雖然Cas的應(yīng)用范圍已經(jīng)得到擴(kuò)展，但是精準(zhǔn)基因組編輯仍然是CRISPR革命的前沿。Cas9和Cas12a能夠在特定位點(diǎn)觸發(fā)雙鏈DNA斷裂，在細(xì)胞通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復(fù)（HDR）對(duì)雙鏈DNA斷裂進(jìn)行修復(fù)后基因組編輯就會(huì)發(fā)生。

作為精準(zhǔn)基因組編輯工具，Cas9和Cas12a能夠在多種細(xì)胞種類和生物中起作用。它們可以用于全基因組篩選來(lái)研究基礎(chǔ)生物功能，或者發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證復(fù)雜遺傳病的潛在藥物靶點(diǎn)。在臨床試驗(yàn)中，Cas核酸酶可以治療由已知遺傳因素導(dǎo)致的疾病，例如在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（DMD）中，使用基因編輯可以修正基因突變或者誘發(fā)轉(zhuǎn)錄過(guò)程跳過(guò)有缺陷的外顯子。Cas9可以用于讓導(dǎo)致肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）和亨廷頓病（Huntington’s disease, HD）等神經(jīng)疾病的致病基因失活。除了對(duì)體細(xì)胞進(jìn)行基因編輯，這一系統(tǒng)還有在人類胚胎中修正基因突變的潛力，從而在人類生殖細(xì)胞中產(chǎn)生可遺傳的變化。

然而，值得注意的是精準(zhǔn)編輯仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)镹HEJ導(dǎo)致的修復(fù)結(jié)果可能與期待的HDR導(dǎo)致的修復(fù)結(jié)果競(jìng)爭(zhēng)。另一種策略是將Cas效應(yīng)子與堿基編輯器（base editor）融合在一起。這可以限制不想要的編輯并且消除修復(fù)模板的需求。與切割DNA然后進(jìn)行修復(fù)不同，切口酶Cas9（nCas9）媒介的堿基編輯將單堿基編輯器攜帶到指定靶點(diǎn)，并且在促進(jìn)堿基變換的同時(shí)不產(chǎn)生雙鏈DNA切割。如今Cas9媒介的單堿基編輯器讓研究人員能夠在特定基因組位點(diǎn)生成任意一種堿基變換結(jié)果。展望未來(lái)，下一代的Cas媒介的基因組編輯器很可能包括堿基編輯器，它們的堿基編輯活性可能通過(guò)構(gòu)象變化，與Cas9媒介的靶點(diǎn)DNA結(jié)合偶聯(lián)在一起。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的各種應(yīng)用（圖片來(lái)源：《科學(xué)》）

使用dCas9調(diào)控轉(zhuǎn)錄過(guò)程

Cas9是一個(gè)模塊式的平臺(tái)，它的DNA結(jié)合能力和核酸酶活性分屬不同的模塊。通過(guò)在Cas9核酸酶蛋白域引入突變，可以生成催化活性缺失的Cas9（dCas9）。它可以成為募集蛋白的骨架，在干擾特定位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄過(guò)程時(shí)不會(huì)對(duì)DNA產(chǎn)生永久的影響。使用dCas9為功能性基因篩檢帶來(lái)革命性的變化，因?yàn)樗屧诙喾N細(xì)胞中進(jìn)行迅速，特異性，高通量的基因敲低成為可能。這些研究進(jìn)展凸顯出在操作基因組的同時(shí)不引入永久性DNA損傷的實(shí)用性。例如，將dCas9與TET1（一種去甲基化酶）融合，可以在脆性X綜合征（fragile X syndrome）神經(jīng)元和小鼠模型中靶向失調(diào)的FMR1位點(diǎn)，并且逆轉(zhuǎn)表型。

使用靶向RNA的Cas在轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行基因工程

與產(chǎn)生永久基因變化相對(duì)，Cas效應(yīng)子可以通過(guò)靶向RNA對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行暫時(shí)干擾。利用呈現(xiàn)PAM序列的寡核苷酸，Cas9系統(tǒng)可以被改造成可編程的RNA編輯工具（RCas9）。RCas9可以用于消除致病RNA，修復(fù)mRNA剪接錯(cuò)誤，或者降低三核苷酸重復(fù)序列表達(dá)的蛋白水平。目前獲得的成功表明，Cas9可能在轉(zhuǎn)錄后基因工程領(lǐng)域大有作為，例如與單堿基RNA調(diào)控子融合來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)特定RNA位點(diǎn)的調(diào)控。

Cas13是靶向RNA領(lǐng)域最新涌現(xiàn)的多功能工具。Cas13a系統(tǒng)是一個(gè)RNA指導(dǎo)的核糖核酸酶（RNase），它可以在哺乳動(dòng)物和植物體內(nèi)用于有特異性地敲低RNA。與Cas13a功能和進(jìn)化相似的Cas13b具備可編程的RNase活性，它已經(jīng)被用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)RNA干擾和RNA編輯。Cas9和Cas13靶向RNA的系統(tǒng)除了支持基礎(chǔ)研究以外，在臨床上可以達(dá)到和反義寡核苷酸療法相似的臨床應(yīng)用，在不產(chǎn)生永久性遺傳變化的情況下，治療急性非孟德爾疾病（acute Mendelian patholgies)。

可編程核酸成像

對(duì)于特定基因組位點(diǎn)，mRNAs，和非編碼RNAs來(lái)說(shuō)，在細(xì)胞中的特定時(shí)空分布對(duì)它們的功能至關(guān)重要。將dCas9與熒光報(bào)告基因融合在一起，研究人員已經(jīng)能夠?qū)蚪M中的重復(fù)位點(diǎn)在活細(xì)胞中進(jìn)行成像。然而，限制dCas9在基因組特定位點(diǎn)分布研究中應(yīng)用的原因是，對(duì)于非重復(fù)序列，這一手段的信噪比較低?？朔旁氡炔蛔愕囊粋€(gè)方法是在sgRNA上附加多個(gè)MS2序列，這些MS2序列能夠與MS2序列結(jié)合蛋白相結(jié)合，而將MS2序列結(jié)合蛋白與熒光蛋白融合在一起，則能夠有效地增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度。使用靶向RNA的RCas9讓研究人員能夠在活細(xì)胞中追蹤RNA，從而讓追蹤攜帶重復(fù)擴(kuò)增序列的RNA成為可能，這具有重要臨床意義。

核酸檢測(cè)和診斷

在Cas13a和Cas12a中RNA指導(dǎo)的核酸酶活性促進(jìn)了創(chuàng)新核酸檢測(cè)工具的研發(fā)。對(duì)于Cas13和Cas12a來(lái)說(shuō)，靶點(diǎn)核酸通過(guò)與指導(dǎo)RNA的堿基配對(duì)，會(huì)激活普通的核酸酶活性。利用這種可控的核酸酶活性，Cas13被用于從大量RNA中檢測(cè)特定RNA序列的存在?；谶@一研究開發(fā)出的SHERLOCK技術(shù)平臺(tái)，能夠同時(shí)檢測(cè)出登革熱和寨卡病毒的單鏈RNA的存在。

SHERLOCK系統(tǒng)科學(xué)論文（圖片來(lái)源：《科學(xué)》）

Cas12a有著與Cas13相似的靶向單鏈DNA的可控核酸酶活性。利用這種活性，DETECTR系統(tǒng)是一個(gè)基于CRISPR的DNA檢測(cè)和診斷技術(shù)平臺(tái)。與等溫預(yù)擴(kuò)增相結(jié)合，DETECTR系統(tǒng)能夠迅速準(zhǔn)確地檢測(cè)出人乳頭瘤病毒（HPV）的臨床相關(guān)類型。

DETECTR系統(tǒng)科學(xué)論文（圖片來(lái)源：《科學(xué)》）

CRISPR-Cas系統(tǒng)的特異性和運(yùn)輸

與小分子藥物或抗體療法的脫靶效應(yīng)相比，Cas核酸酶的脫靶效應(yīng)尤其危險(xiǎn)，因?yàn)樗鼤?huì)造成基因組的永久性改變。因此，改進(jìn)Cas的特異性和靶向運(yùn)送尤為關(guān)鍵。研究人員已經(jīng)在改進(jìn)Cas酶和sgRNA設(shè)計(jì)上取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，大幅度提高了核酸酶的特異性。而且，預(yù)測(cè)靶向結(jié)果的工具和對(duì)基因表達(dá)的時(shí)空調(diào)控為降低脫靶效應(yīng)提供了全面的應(yīng)對(duì)策略。

優(yōu)化運(yùn)送Cas系統(tǒng)的載體仍然是一個(gè)重大挑戰(zhàn)，特別是在人體可以對(duì)sgRNA和Cas產(chǎn)生免疫反應(yīng)的情況下。在實(shí)驗(yàn)室中，研究人員可以使用電穿孔、轉(zhuǎn)染、直接注射等方法將編碼Cas系統(tǒng)的DNA、mRNA、或RNA蛋白復(fù)合體導(dǎo)入細(xì)胞中。但是，其中很多種方法在臨床條件下并不適用。而且，將個(gè)體較大的Cas核酸酶與指導(dǎo)RNA結(jié)合形成的復(fù)合體裝進(jìn)病毒載體仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。解決這個(gè)問(wèn)題的一個(gè)策略是利用個(gè)體較小的Cas同系物，或者對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行最小化，以便將它們裝進(jìn)病毒載體。另外一種方法是使用納米材料完成對(duì)特定細(xì)胞種類的定向運(yùn)輸。最近的研究表明，直接注射攜帶Cas9-sgRNA的納米顆粒在小鼠模型中能夠糾正DMD突變，導(dǎo)致臨床癥狀得到緩解。未來(lái)基于CRISPR療法的成功，很大程度上依賴于運(yùn)送Cas系統(tǒng)載體方面的進(jìn)一步研發(fā)。

結(jié)語(yǔ)和未來(lái)

CRISPR-Cas技術(shù)提供了一種修改、調(diào)控和觀察基因組的便捷、而且具備很強(qiáng)適應(yīng)性的工具。這讓它可以在廣大領(lǐng)域中得到生物研究和生物技術(shù)方面的應(yīng)用。CRISPR-Cas工具極大地加快了科學(xué)研究的腳步，而基于Cas的生物技術(shù)的研發(fā)同樣進(jìn)步迅速。多項(xiàng)基于Cas9的臨床試驗(yàn)正在或即將進(jìn)行。這些臨床試驗(yàn)的結(jié)果將指引未來(lái)體細(xì)胞基因編輯在體外和患者中的應(yīng)用。CRISPR-Cas9在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用已經(jīng)產(chǎn)生了可以進(jìn)入市場(chǎng)的產(chǎn)品。CRISPR-Cas工具箱日漸擴(kuò)展的應(yīng)用確立了這一系統(tǒng)在基因組編輯，甚至是基因工程領(lǐng)域的前沿位置。

參考資料：

[1] Knott and Doudna. (2018). CRISPR-Cas guides the future of genetic engineering. Science, https://doi.org/10.1126/science.aat5011