肉毒桿菌及肉毒素

肉毒素簡介

肉毒毒素(Botulinum neurotoxin，BoNT)是由厭氧的肉毒桿菌在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種細(xì)菌外毒素，它能引起死亡率極高的中毒。自古以來，倒在這種毒素下的人類生命不計其數(shù)，而且在西方尤其多見。西方人很早就發(fā)現(xiàn)，吃肉制品容易發(fā)生肉毒素中毒癥。Botulinum這個詞匯，就源自于“肉腸”的拉丁文botulus；而中文譯為“肉毒素”也是這個緣故。在分子數(shù)相同的條件下，其致死力是白喉毒素的300倍，蓖麻毒素的3萬倍，銀環(huán)蛇毒素的300萬倍，箭毒的10億倍，是目前已知的毒力最強的分子，被美國疾病控制預(yù)防中心(CDC)列為A級生物恐怖劑。

肉毒梭菌及其毒素根據(jù)毒素抗原性的不同，將其分為A、B、C、D、E、F和G七個亞型。其中A、B、E、F為人中毒型別，C、D型為動物和家禽的中毒型別。C型肉毒梭菌在自然界廣泛分布。飲食污染有C型肉毒梭菌特別是C型肉毒毒素的水源或草料的動物有可能發(fā)生C型肉毒中毒。動物中毒后，20小時左右甚至幾小時內(nèi)即可致死，死亡率極高，常常來不及用抗毒素進行特異性治療。肉毒中毒發(fā)生后，若不及時采取措施，則會引起其它食肉動物因食用中毒動物尸體而死亡或攜帶肉毒梭菌，造成肉毒梭菌在自然界中的傳播與潛伏，有可能引起范圍更廣、更嚴(yán)重的肉毒中毒，并危害人類健康。

肉毒毒素不耐熱，90℃情況下2分鐘可完全破壞；不耐堿，溶解在pH11的堿性溶液中3分鐘就可滅活。肉毒毒素溶液加0.6%的福爾馬林37℃下作用一個月以上可失去毒性，但仍保持抗原性和免疫原性，成為類毒素。肉毒素對乙醇穩(wěn)定；但可被鹵素滅活。粗制毒素較精制毒素穩(wěn)定。毒素溶液在pH6.0，4℃下保存，效價可保持半年不變。凍干毒素在低溫條件下可長期保存，毒性下降緩慢。

肉毒素發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用史

19世紀(jì)20年代：德國醫(yī)生Justinus Kerner從變質(zhì)的香腸中發(fā)現(xiàn)了一種引起食物中毒的毒素。由于Kerner的“香腸之毒”導(dǎo)致麻痹癱瘓性疾病，因而獲得了“肉毒之毒”(來源于拉丁文“botulus”)的稱號。Kerner推測，小劑量的肉毒素也許可以用于治療神經(jīng)紊亂性疾病以及多汗癥。1895年，比利時細(xì)菌學(xué)家Emile Pierre van Ermengem發(fā)現(xiàn)，肉毒桿菌可以產(chǎn)生肉毒素。20世紀(jì)20年代，美國舊金山加利福尼亞大學(xué)的Herman Sommer博士以穩(wěn)定的酸沉淀形式最先從肉毒桿菌中提煉出A型肉毒素。

20世紀(jì)40年代，第二次世界大戰(zhàn)期間，美國科學(xué)家開始探索肉毒素的潛在用途，試圖將它變成戰(zhàn)爭的武器。1949年，在英國倫敦，研究人員Arnold Burgen博士和他的同事們發(fā)現(xiàn)，肉毒素可以阻斷神經(jīng)和肌肉的聯(lián)系。20世紀(jì)60年代，舊金山眼科醫(yī)生Alan Scott將肉毒素注射入猴子體內(nèi)，觀察它們是否可以令導(dǎo)致斜視的肌肉放松下來。1978年，Scott醫(yī)生獲得了美國食品和藥物管理局(FDA)的批準(zhǔn)，進行關(guān)于肉毒素用于治療人類斜視問題的廣泛動態(tài)測試。他將這種藥物命名為Oculinum，并且創(chuàng)建了Oculinum公司來生產(chǎn)及出售這種藥物。1989年，Oculinum獲美國FDA批準(zhǔn)用于治療斜視及眼瞼顫動。

1986年，加拿大Carruther夫婦在用肉毒桿菌毒素治療眼瞼痙攣時，意外的發(fā)現(xiàn)了其良好的除皺效果。隨后，他們相繼用肉毒素對額紋、眉間紋、魚尾紋進行了治療，經(jīng)過了一系列嘗試，于1992年首先報道，Carruther夫婦就成了此項技術(shù)的發(fā)明者和先驅(qū)。2002年4月15日，肉毒素獲美國FDA批準(zhǔn)用作醫(yī)學(xué)美容材料，主要用于注射除皺，暫時性地改善中度至重度的眉間皺紋，這一重大事件無疑使肉毒素成為愛美人士的“面部救星”。時至今日，肉毒素仍然是很多愛美之人瘦臉、除皺的理想選擇。1993年，中國蘭州生物制品研究所自主研發(fā)的A型肉毒素制品——衡力問世。2006年，GSK在中國上市保妥適(BOTOX)。

肉毒素的作用機制

Crystal structure of botulinum neurotoxin A1 (BoNT/A1)

肉毒素是一種蛋白類毒素。菌株細(xì)胞內(nèi)所翻譯的原初蛋白為150kDa的一條多肽鏈；隨后通過蛋白酶的作用，在跨越二硫鍵的環(huán)狀區(qū)域進行切割，形成成熟的肉毒毒素，由50kDa的輕鏈(L鏈)及100kDa重鏈(H鏈)構(gòu)成，如上圖所示。重鏈和輕鏈之間通過一個分子內(nèi)二硫鍵及不同結(jié)構(gòu)域間的非共價相互作用而構(gòu)成三維結(jié)構(gòu)。目前科學(xué)人員已經(jīng)解析了BoNT/A1，BoNT/B1及BoNT/E1的晶體結(jié)構(gòu)。同其他作用于細(xì)胞內(nèi)靶點的細(xì)菌毒素類似，BoNT也由功能不同的結(jié)構(gòu)域所組成：輕鏈編碼毒性功能區(qū)，為一金屬蛋白酶活性區(qū)域，能夠特異性切割SNARE家族蛋白，后者對于神經(jīng)遞質(zhì)的分泌是必須的；HN結(jié)構(gòu)域?qū)τ谳p鏈穿越內(nèi)吞小體轉(zhuǎn)位至神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)至關(guān)重要；而HC結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)突觸前結(jié)合和內(nèi)吞，其自身由兩個不同結(jié)構(gòu)的亞結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成。氨基酸序列的保守性及結(jié)構(gòu)分析表明：BoNT/C， BoNT/D和BoNT/G同BoNT/A及BoNT/B較為相似；而BoNT/E同BoNT/F之間相似度更高。肉毒毒素通常是由神經(jīng)毒素和血凝素組成的復(fù)合形式存在。

Neurotransmission at synapses

肉毒素的毒性機理主要為抑制神經(jīng)遞質(zhì)對細(xì)胞信號的傳遞過程?；瘜W(xué)突觸中的信號是由神經(jīng)遞質(zhì)介導(dǎo)的，這些神經(jīng)遞質(zhì)從突觸前神經(jīng)末梢釋放出來，并與位于突觸后細(xì)胞(如肌肉或外分泌細(xì)胞)的受體結(jié)合。神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)元胞漿中合成，并儲存在突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)的小突觸小泡中。在突觸囊泡腔中神經(jīng)遞質(zhì)的積累主要是由質(zhì)子電化學(xué)梯度所驅(qū)動，后者由ATPase質(zhì)子泵產(chǎn)生的，它位于突觸囊泡膜上并利用ATP水解釋放的能量將ATP泵入突觸小泡。突觸小泡在神經(jīng)末梢形成一個神經(jīng)遞質(zhì)的儲備池，并與突觸前膜成為活性區(qū)域的特定部位結(jié)合，稱為“docking”。多種蛋白分子逐步形成一個較大的復(fù)合體，來完成突觸小泡的docking過程。該復(fù)合體包括兩個突觸囊泡上的膜蛋白，VAMP (synaptobrevin)及Syt (synaptotagmin)；兩種位于突觸前膜的蛋白，SNAP25及syntaxin；以及胞漿蛋白complexin和Munc18，來參與后續(xù)步驟，即使得突觸囊泡能夠響應(yīng)鈣離子內(nèi)流的信號而快速同突觸前膜區(qū)域相融合。Syt分子同突觸前膜上的肌醇磷脂分子相互作用，而VAMP則同SNAP25及syntaxin形成coiled-coil結(jié)構(gòu)，也被稱之為SNARE復(fù)合體。Docking過程完成后，complexin同Munc18一起發(fā)揮剎車的作用而阻止融合過程的即刻發(fā)生，并促進其他蛋白形成一個更大的超級SNARE復(fù)合體，這也是介導(dǎo)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的最核心結(jié)構(gòu)。神經(jīng)末梢的去極化會導(dǎo)致膜上鈣離子通道的打開以及大量鈣離子的進入，從而引發(fā)復(fù)合體的快速構(gòu)象變化，使得突觸囊泡與突觸前膜融合而將神經(jīng)遞質(zhì)釋放至突觸間隙。神經(jīng)遞質(zhì)擴散到神經(jīng)末梢，并與突觸后受體結(jié)合，從而觸發(fā)突觸后細(xì)胞的信號傳導(dǎo)。在神經(jīng)遞質(zhì)釋放過程中，突觸囊腔瞬時對外開放，但隨后通過內(nèi)吞作用內(nèi)化入神經(jīng)末梢。神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐和內(nèi)吞是嚴(yán)格耦合的：一個過程的抑制導(dǎo)致另一個過程的抑制。內(nèi)化和脫殼后，突觸小泡再次填充入神經(jīng)遞質(zhì)，神經(jīng)傳遞的下一個周期重新開始。

Binding and trafficking of botulinum neurotoxins inside nerve terminals

在體內(nèi)，肉毒毒素特異性的與膽堿能神經(jīng)末梢突觸前膜的表面受體相結(jié)合，然后由于吸附性胞飲而內(nèi)轉(zhuǎn)進入細(xì)胞內(nèi)稱為毒素的內(nèi)轉(zhuǎn)(internalization)，使囊泡不能再與突觸前膜融合，從而有效地阻抑了膽堿能神經(jīng)介質(zhì)——乙酰膽堿的釋放。與此同時，毒素與突觸前膜結(jié)合，還阻塞了神經(jīng)細(xì)胞膜的鈣離子通道，從而干擾了細(xì)胞外鈣離子進入神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)以觸發(fā)胞吐和釋放乙酰膽堿的能力。乙酰膽堿釋放的抑制，有效地阻斷了膽堿能神經(jīng)傳導(dǎo)的生理功能，尤其是神經(jīng)——肌肉接頭部位特別敏感，引起全身隨意肌松弛麻痹，呼吸肌麻痹是致死的主要原因。

肉毒素的應(yīng)用

20世紀(jì)70年代初美國舊金山眼科研究所的Scott醫(yī)師從肉毒中毒病人最先累及眼外肌，引起視力模糊、眼瞼下垂、瞳孔散大和復(fù)視等癥狀并緩慢恢復(fù)的過程中得到啟示，與世界著名肉毒毒素專家、美國威斯康星大學(xué)食品微生物及毒素學(xué)系Schantz教授合作，在猴實驗基礎(chǔ)上將肉毒毒素引入眼科疾病治療，并在1980年首次報告眼外肌注射A型肉毒毒素替代斜視手術(shù)治療的可能性。此后他和其他臨床專家對肉毒毒素的臨床效果、副作用及免疫學(xué)反應(yīng)進行了大量的實驗研究，并在斜視、眼瞼痙攣、面肌痙攣等疾病的治療中取得了令人鼓舞的結(jié)果。迄今，國外報道肉毒毒素已可用于眼科、神經(jīng)科、康復(fù)科、消化科、泌尿科、皮膚科及美容科等50余種病癥(很多是疑難雜癥、難治之癥)的治療。

肉毒素類藥物中的明星BOTOX(保妥適)

市售的A型肉毒毒素產(chǎn)品至少有6種：OnabotulinumtoxinA (美國BOTOX，Allergan)，BTXA (中國衡力，蘭州生物制品研究所)，Abobotulinumtoxin A (英國Dysport，Ipsen Ltd)，Rimabotulinumtoxin B (美國Neurobloc，Solstice Neurosciences)，neu-BoNT/A (韓國Neuronox，Medytox)，Incobotulinumtoxin A (德國Xeomin，Merz Pharmaceuticals)。這些產(chǎn)品根據(jù)分子特性和血清類型分為3類：A型復(fù)合肉毒毒素(onabotulinumtoxin A，bobotulinumtoxin A，BTXA和neu-Bo NT/A)、A型復(fù)合游離肉毒毒素(incobotulinumtoxin A)和B型肉毒毒素(rimabotulinumtoxin B)。這其中，onabotulinumtoxin A自1989年在美國獲批后一直占據(jù)市場，Abobotulinumtoxin A緊隨其后，自2009年FDA批準(zhǔn)其用于治療頸部肌張力障礙和重度眉間紋后，就一直在歐洲、亞洲、拉丁美洲和美國應(yīng)用。Incobotulinumtoxin A于2005年在德國問世，在美國應(yīng)用。neu-BoNT/A于2006年在韓國獲批用于治療眼瞼痙攣，已在亞洲和拉丁美洲國家成為最為接受的肉毒毒素產(chǎn)品之一，在日本、韓國、泰國等用于治療和美容適應(yīng)癥。對于肉毒素類產(chǎn)品適應(yīng)癥多樣性的研究正如火如荼的展開，其中BOTOX還登上了2017年1月16日時代雜志的封面。

BOTOX實際是A型肉毒桿菌毒素，其活性成分為BoNT/A復(fù)合物，分子量約為900kDa，由一個神經(jīng)毒素分子、一個非毒素非凝集素蛋白和血紅蛋白凝集素(HA)蛋白構(gòu)成。這是一種神經(jīng)毒劑，可以抑制運動神保妥適經(jīng)沖動的傳遞，而使局部肌肉不能收縮或是肌肉張力下降。1989年，A型肉毒桿菌毒素正式注冊為商品，商標(biāo)為“BOTOX”，并被美國食品藥品管理局(FDA)核準(zhǔn)用于12歲以上的肌肉張力性疾病，如斜視，眼肌痙攣等的治療，近幾年才被用于美容整形，主要是治療面部皺紋。BOTOX注入產(chǎn)生皺紋的肌肉內(nèi)，會阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放，從而使肌肉張力下降或是肌肉癱瘓麻痹，皺紋也隨之而逐漸消失，皺紋去除效果頗佳，特別是對額紋(抬頭紋)、眉間紋、魚尾紋，且操作簡單，幾乎無痛苦，無腫脹瘀血，見效快，不發(fā)生過敏反應(yīng)等，故這種除皺方法推出后，被許多求美者所接受。

BOTOX發(fā)現(xiàn)及FDA批準(zhǔn)歷程

在Alan Scott(艾倫.斯考特)教授先驅(qū)性地將A型肉毒毒素應(yīng)用于治療斜視和眼瞼痙攣的實驗后，艾爾建公司獲得了他的授權(quán)技術(shù)并使該產(chǎn)品通過了FDA批準(zhǔn)，用于一系列治療及美容適應(yīng)癥：1989年獲批用于治療眼瞼痙攣和斜視；2002年獲批用于治療中度至重度眉間紋；2013年獲批用于治療眼外眥皺紋(魚尾紋)。2016年，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了BOTOX用于治療成人患者的下肢痙攣。這是FDA批準(zhǔn)的第一種也是唯一一種肉毒桿菌毒素產(chǎn)品，用于治療上肢(肘部、腕部、手指和拇指)和下肢可能受到痙攣影響的多個肌肉群。另外，近些年BOTOX還獲批用于上肢痙攣、慢性偏頭疼、神經(jīng)性尿失禁、膀胱過度活動綜合征等多種適應(yīng)癥。全球范圍內(nèi)，保妥適在過去的20年中已獲83個國家的批準(zhǔn)，被用于27種不同的適應(yīng)癥。BOTOX是一座名副其實的超級“金礦”，而且從目前看來，這座金礦似乎絲毫未現(xiàn)枯竭之態(tài)。

原標(biāo)題：肉毒素的故事——不只用于美容

縮略詞：

BoNT：botulinum neurotoxins

CNS：central nervous system

HSA：human serum albumin

HC：carboxy-terminal partof heavy chain

HC-C：C-terminal part ofthe HC domain

HC-N：N-terminal part of HC

HN：amino-terminal partof heavy chain

L：light chain

PSG：polysialoganglioside

PTC：progenitor toxin complexes

SV：synaptic vesicle

VAMP：vesicle-associated membrane protein

SNARE：soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor

參考文獻(xiàn)：

1.AbobotulinumtoxinA:A 25-Year History. Aesthet Surg J. 2017 May 1；37(suppl_1):S4-S11. doi: 10.1093/asj/sjw284.

2.https://en.wikipedia.org/wiki/Botulinum_toxin

3.Botulinum Neurotoxins: Biology，Pharmacology，and Toxicology. Pharmacol Rev. 2017 Apr；69(2): 200–235.

4.Currentand potential urological applications of botulinum toxin A. Nat Rev Urol. 2015Sep；12(9):519-33. doi:10.1038/nrurol.2015.193.

5. http://www.botox.com/