殺鼠靈和華法林的故事已經(jīng)流傳了半多個(gè)世紀(jì)，作為全世界最暢銷的滅鼠藥和最廣泛的抗凝血藥，其故事本身就是一個(gè)傳奇。本文將隨著卡爾·保羅·林克(Karl Paul Link)教授的腳步親歷其不為人知的背后。

前言

故事始于1923年，在美國(guó)北達(dá)科他州(North Dakota)和加拿大亞伯達(dá)州(Alberta)的牧場(chǎng)，牛羊們致命出血的新疾病幾乎同時(shí)在這些地區(qū)蔓延開來(lái)。牧民們對(duì)牛羊們做一些很平常且不足以威脅它們生命的操作(如切除牛角或閹割)時(shí)，牛羊們很容易因?yàn)閭跓o(wú)法凝固而不停出血最后導(dǎo)致死亡。獸醫(yī)Frank Schofield和Roderick進(jìn)行調(diào)查得出結(jié)論：既非致病生物亦非營(yíng)養(yǎng)不良導(dǎo)致這種疾病，其根源追溯到發(fā)霉的甜三葉草。因而在獸醫(yī)業(yè)該疾病被命名為“甜三葉草病”(又稱甜苜蓿病)，當(dāng)?shù)谝淮斡^察到這種疾病時(shí)，在某種意義上并沒(méi)有在動(dòng)物病理學(xué)和人類醫(yī)學(xué)上進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)牛和羊吃了這種變質(zhì)的三葉草后，大約15天后凝血功能逐步減少，在30-50天后因內(nèi)出血致死。

Schofield和Roderick經(jīng)過(guò)驗(yàn)證得出結(jié)論：這個(gè)疾病是可逆的！通過(guò)喂食時(shí)撤回這種發(fā)霉的干草，再用從正常的牛羊身上抽出的新鮮血液進(jìn)行輸血，這些生病的牛羊?qū)⒉辉俪鲅酝鉂B。甚至在已快絕望的病牛羊身上，在輸血和改用好的干草喂食后，也有希望愈合。

在經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜和深入的病毒和生理研究后，1931年Roderick強(qiáng)調(diào)：導(dǎo)致凝血延遲或消失的原因是凝血素不足，與嚴(yán)重的出血性疾病并行的是凝血素?cái)?shù)量或活性的減少。他遵照美國(guó)偉大的凝血先驅(qū)W.H.Howell教授開發(fā)的方法進(jìn)行這項(xiàng)研究，使用Howell的丙酮法通過(guò)沉淀正常?？苿?dòng)物的血漿制備凝血素，再加入“甜三葉草血”促進(jìn)凝血。通過(guò)對(duì)比，使用平行方式從“甜三葉草血”制備的凝血素不能凝血。在當(dāng)時(shí)所知的其他維持正常凝血功能的成份(纖維蛋白原，鈣，血小板和抑制物等)都不受影響。

我第一次獲悉在牛身上發(fā)生的甜三葉草出血病是在1932年12月，時(shí)任美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)(University of Minnesota)生物化學(xué)部負(fù)責(zé)人Ross A. Gortner，他發(fā)給我一封郵件并讓我去圣保羅考慮這個(gè)事情。因?yàn)樵诿髂崽K達(dá)州，“甜三葉草病”也是一個(gè)未解的問(wèn)題，如果我選擇接受的話，這個(gè)項(xiàng)目將會(huì)開展研究。Gortner將Roderick原版資料提供給我。在Gortner的生物化學(xué)部，許多人嘗試過(guò)提取凝血素試劑，但是像Roderick和其他人一樣，他們都失敗了。

1933年1月，我們團(tuán)隊(duì)“正式”開始研究甜三葉草病問(wèn)題，但與我們合作的遺傳學(xué)部門的R.A.Brink教授和W.K.Smith教授研發(fā)方向卻不相同。他們尋求開發(fā)一種更適合或不受威斯康星州氣候影響的甜三葉草菌株—香豆素。盡管香豆素聞起來(lái)味道香甜，但嘗起來(lái)是苦澀的。通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，?；蛘咄米邮紫雀敢獬钥辔陡俚闹参铩?/p>

農(nóng)場(chǎng)悲劇

且不說(shuō)“正式”開始研究涉及的口味問(wèn)題，我們實(shí)驗(yàn)室首先遇到直接催化碰撞來(lái)自農(nóng)業(yè)實(shí)踐。

那是1933年2月的一個(gè)周六下午，屋外暴風(fēng)雪咆哮，溫度在0攝氏度徘徊，在與Brink進(jìn)行第一次會(huì)談后，實(shí)驗(yàn)室闖進(jìn)來(lái)一位陌生來(lái)客。ED Carlson，這位來(lái)自威斯康星州鹿園鄰近，距麥迪遜(Madison)近190英里的農(nóng)民，攜帶著A.J.Carlson教授后來(lái)所稱的“證據(jù)”。“甜三葉草病”在他的農(nóng)場(chǎng)猖獗，之前他用干草喂養(yǎng)牛群未遇到任何問(wèn)題，而現(xiàn)在他對(duì)獸醫(yī)的診斷持懷疑態(tài)度。獸醫(yī)建議他到農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站尋求真相，此時(shí)州立獸醫(yī)辦公室已關(guān)門，純屬巧合之下他來(lái)到了生物化學(xué)樓。

ED Carlson所攜的證據(jù)是了一頭死掉的小母牛，一罐完全沒(méi)有凝血功能的血液，和大約100磅發(fā)霉的甜三葉草 — 這是他唯一所能用來(lái)喂牛的干草。他描述的整個(gè)疾病過(guò)程與典型的“甜三葉草毒害”圖片完全一致。12月底他損失了2頭小母牛，到了1月，他最喜愛的老牛之一，在其大腿上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)大血腫，隨后皮膚膿皰致命性快速出血，最后2只小牛在周五死掉了，而他家的公牛正從鼻子里往外滲血，為此他冒著暴風(fēng)雪來(lái)到麥迪遜。

我不得不立即告訴ED Carlson，目前我們所能做得也僅僅是Roderick和Schofield所教的建議：如果他想拯救它們，就必須停止用那些干草喂養(yǎng)，如果有可能的話要給這些病牛輸血，未來(lái)會(huì)有可能出現(xiàn)有效的措施避免這種病，但不是現(xiàn)在。下午四點(diǎn)我目送他離開，從我們實(shí)驗(yàn)室到他家農(nóng)場(chǎng)之間這190英里漂泊的道路對(duì)他來(lái)說(shuō)就像一個(gè)危險(xiǎn)而昏暗的海洋。

我不能花費(fèi)時(shí)間講述關(guān)于雙香豆素故事的所有細(xì)節(jié)，但是我向你們保證這對(duì)我影響巨大。當(dāng)ED Carlson來(lái)見我們的時(shí)候，我的學(xué)生Schoeffel，1926年來(lái)到美國(guó)獲得農(nóng)業(yè)化學(xué)文憑，一個(gè)反復(fù)無(wú)常的斯瓦比亞人，在實(shí)驗(yàn)室目睹了這一切。他在芝加哥畜牧場(chǎng)做了兩年學(xué)徒之后，1929年開始隨我學(xué)習(xí)。Schoeffel是一個(gè)有趣、充滿活力和忠誠(chéng)的人，有時(shí)比較神秘，日常的對(duì)話也經(jīng)常從哥德的浮士德、莎士比亞和圣經(jīng)中引用。當(dāng)ED Carlson離開后，Schoeffel來(lái)回地在實(shí)驗(yàn)室怒罵、咆哮：“上帝啊，一個(gè)農(nóng)民開著小破車在暴風(fēng)雪中掙扎了近200英里，然后被告訴沒(méi)有其他辦法，并被許諾或許未來(lái)可能會(huì)出現(xiàn)有效措施，五年、十年、十五年，也可能永不！誰(shuí)知道呢？用好的干草喂養(yǎng) — 輸血！哦，上帝，如果你沒(méi)錢你能怎么做？”他把他的手反復(fù)浸入牛奶罐中，喃喃自語(yǔ)：“血液，血液。他回到家能發(fā)現(xiàn)什么呢？病牛。然后明天他和他的女人去教堂祈禱，祈禱，再祈禱，到周一呢？更多的死牛！他沒(méi)辦法用好的干草喂養(yǎng) — 他沒(méi)錢買。如果他失去他所有的牛，天??！天?。∥覀儜?yīng)該阻止死亡。”

直至下午7點(diǎn)我們才把血液和干草放好，當(dāng)我離開實(shí)驗(yàn)室回家的時(shí)候，Schoeffel一把抓住我的肩膀，正視著我說(shuō)：“在你走之前，我要告訴你一些事，我會(huì)清理并在周一早上交給你一份文檔。”

生物鑒定研發(fā)

我們面臨的基本問(wèn)題：沒(méi)有建立當(dāng)前出血試劑的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，因而提供小型試驗(yàn)動(dòng)物(兔子)用來(lái)做生物鑒定，意味著通過(guò)測(cè)試干草和提取制備以評(píng)估抗凝劑活性。

Roderick先前的文獻(xiàn)中非常清晰明確一個(gè)觀點(diǎn)：甜三葉草病是可逆的！吃了變質(zhì)的干草(甚至長(zhǎng)期吃變質(zhì)的干草)，不會(huì)引起永久的功能性變異，不會(huì)引起顯而易見的形態(tài)學(xué)上改變，也不會(huì)引起肝臟中可檢測(cè)的病理學(xué)變異，假定肝臟是合成凝血素的主站點(diǎn)。然而，開發(fā)一個(gè)可行而簡(jiǎn)單的生物鑒定的前景不明，前景暗如奶牛的內(nèi)部。我們對(duì)復(fù)雜的凝血問(wèn)題沒(méi)有任何經(jīng)驗(yàn)。

Schoeffel和Roberts首先指出用來(lái)評(píng)估凝血素活性的Howell教授的方法不能滿足精度的要求。Smith和Roberts指出整個(gè)凝血時(shí)間變量太大，用于測(cè)試整個(gè)血漿的“快速1-階(Quick 1-stage)法”還有待改進(jìn)。Smith同時(shí)指出用標(biāo)準(zhǔn)劑量50g變質(zhì)干草喂不同的兔子，其響應(yīng)變量亦非常大。因而Campbell和Smith繁殖飼養(yǎng)了一群易感染的兔子用以生物鑒定。

1935-1938年期間，在凝血專家們之間存在一個(gè)血腥而又有趣的激烈爭(zhēng)論：如何評(píng)估“凝血素濃度或活性” — 應(yīng)該用Howell教授的“快速1-階法”，或者H.P.Smith與合作者開發(fā)的“2-階法”。而我們則設(shè)法置身爭(zhēng)論之外 。1938年Campbell最終克服了最主要障礙，他采用“快速1-階法”檢測(cè)濃度在12.5%-8.34%的稀釋血漿的凝固性。他通過(guò)快速分析兔子在喂任何預(yù)備物之前24-36小時(shí)，抽血后快速進(jìn)行血漿凝結(jié)測(cè)試，并對(duì)每一只兔子測(cè)試血漿和正常血漿進(jìn)行對(duì)比，來(lái)排除一些內(nèi)在日常的變量。通過(guò)使用單獨(dú)的標(biāo)準(zhǔn)兔子，并依據(jù)目前存在的生物變異問(wèn)題采用嚴(yán)格的評(píng)估會(huì)大大減少差異。而我們的目標(biāo)是制備一種物質(zhì)，可以消除牛血液中凝血性。用1-階法進(jìn)行生物鑒定血漿凝血性需要改變了，那些有評(píng)估價(jià)值的兔子也在評(píng)估過(guò)程中死掉了。其中一只被命名為Bess Campbell的兔子在長(zhǎng)達(dá)5年時(shí)間里被用于200項(xiàng)個(gè)別評(píng)估。

雙香豆素的離析、結(jié)晶 、鑒定、合成

從1933年2月那個(gè)宿命的周六到1939年6月，Smith、Robberts和Campbell進(jìn)行了一項(xiàng)長(zhǎng)期艱苦的跟蹤研究，其工作臺(tái)上展示了所研究的抗凝劑。我更愿意詳述變質(zhì)甜三葉草中存在的一些化學(xué)品提取、分離和離析的問(wèn)題。這種干草確實(shí)是一種生化混雜物，并產(chǎn)生許多非活性產(chǎn)品，一些是新產(chǎn)品，大部分是老產(chǎn)品。但是現(xiàn)在并不足以聲稱，那個(gè)火熱沸騰而又激情昂揚(yáng)的希望并沒(méi)有成為現(xiàn)實(shí)。那個(gè)出血試劑偶爾出現(xiàn)，像薊種子的冠毛一樣在我們面前盤旋，像鬼火一樣躲避我們。曾經(jīng)它一度被認(rèn)為是一種類似葉綠素的物質(zhì)—脫鎂葉綠素。

1939年6月28日黎明前的昏暗，經(jīng)過(guò)一整夜的奮戰(zhàn)，Campbell終于在一個(gè)顯微鏡載片上看到后來(lái)被證明是雙香豆素的晶體。兩個(gè)小時(shí)之后他收集到大約6g晶體。早上當(dāng)我到達(dá)實(shí)驗(yàn)室的時(shí)候，Campbell正在長(zhǎng)沙發(fā)上睡覺，房門由Chet Boyles守衛(wèi)。Boyles是Campbell是實(shí)驗(yàn)助理，他是一名出色的動(dòng)物訓(xùn)練員。當(dāng)我進(jìn)入房間時(shí)，Boyles正在從一裝著上層含95%乙醇的瓶中抿了一小口，一眼未眨對(duì)我說(shuō)：“博士，我正在慶祝，Campy中獎(jiǎng)了！”這次Boyles的猜測(cè)是正確的，Campbell已經(jīng)獲得雙香豆素，其確定它的抗凝血潛能的第一次生物鑒定也已在進(jìn)行。但是直到2天后拿到評(píng)估的結(jié)果，Campbell才來(lái)向我報(bào)道。

Campbell是一個(gè)不善于表達(dá)感情的人，但是這一次他卻像個(gè)小男孩第一次釣到大魚一樣暗自開心。他把小瓶遞給我：“這是H.A.！(H.A.是出血試劑實(shí)驗(yàn)室縮寫)”。我不能透露出Boyles已向我泄秘，我告訴Campbell有兩句德國(guó)詩(shī)非常適合這一時(shí)刻：

我們給Schoeffel發(fā)了簡(jiǎn)短的電報(bào)，他當(dāng)時(shí)正在芝加哥的美國(guó)藥物醫(yī)學(xué)會(huì)管理實(shí)驗(yàn)室。他立即回復(fù)了200個(gè)字的電報(bào)，明確他完全信任我們。我們立即開始物質(zhì)分離，并累積收集了約1800g的抗凝血晶體。檢測(cè)它的結(jié)構(gòu)的問(wèn)題由敏感而又才華橫溢的C.F.Huebner負(fù)責(zé)，他用豐富的想象力做出了正確的結(jié)構(gòu)診斷，如3,3’-雙苯基膦甲烷(4-羥基香豆素)。在1940年的四月愚人節(jié)那天，他把視線鎖定在了合成路線上。合成的和天然的產(chǎn)品都顯示出相同的化學(xué)性質(zhì)。隨后，Overman和Sullivan通過(guò)對(duì)兔子、大鼠、天竺鼠、小鼠和狗實(shí)施仔細(xì)地測(cè)試后，證明天然和合成的產(chǎn)品生物性一致。

4-羥基香豆素的3-取代衍生物的結(jié)構(gòu)檢測(cè)顯示，普通以及苦味的三葉草在從新鮮綠草趨向干草的過(guò)程，由于不正確的處理會(huì)導(dǎo)致出血，主要是基于香豆素分子。在變質(zhì)生化過(guò)程中，香豆素被氧化成4-羥基香豆素，再與甲醛結(jié)合導(dǎo)致生成雙香豆素。

雙香豆素的生理作用

在大量合成雙香豆素之后，快速建立其生理作用就成為了必需。實(shí)驗(yàn)顯示根據(jù)其形狀和劑量，低凝血酶原血(Hypoprothrombinemia，血漿凝血素凝固時(shí)間)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間會(huì)發(fā)生變化，形成響應(yīng)滯后。對(duì)每一物種用特定單一劑量水平進(jìn)行測(cè)試會(huì)得到最有效的響應(yīng)。低于這個(gè)劑量水平，有效性影響會(huì)降至臨界點(diǎn)，而高于這個(gè)劑量水平，藥品會(huì)被完全吸收。

由于藥品發(fā)揮作用之前12-24小時(shí)的潛伏期或滯后期，隨后重復(fù)實(shí)施會(huì)產(chǎn)生累積效應(yīng)。可以預(yù)見在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)，這種作用會(huì)因個(gè)體存在差異，當(dāng)劑量個(gè)性化時(shí)才會(huì)得到不出血的最佳治療效果。

小結(jié)：

1、兔子、大鼠、天竺鼠、小鼠、狗、貓和雞因物種差異導(dǎo)致響應(yīng)差異，并且這種差異會(huì)隨著每個(gè)個(gè)體的年齡和敏感性的不同而不同。廣泛地講，大鼠和小鼠最敏感，貓和狗次之，兔子、牛和雞最不敏感。

2、飲食中維生素K和C的水平不僅影響抗凝作用的強(qiáng)度，同時(shí)也影響著持續(xù)時(shí)間。

3、動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)狀況會(huì)影響抗凝血響應(yīng) — 所有種群空腹時(shí)都會(huì)增強(qiáng)這種響應(yīng)。

4、任何已存在的低凝血酶原血，由水楊酸(阿司匹林)、磺胺類藥物，或輕微氯仿麻醉誘導(dǎo)的響應(yīng)都能被增強(qiáng)。

5、肝腎功能同樣會(huì)影響響應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。

6、目前存在影響肝臟的整體功能性藥，如甲基黃嘌呤和洋地黃藥物，會(huì)產(chǎn)生輕微但是明確可檢測(cè)到的反作用。

7、懷孕或哺乳期婦女對(duì)藥物的抗凝血性作用會(huì)產(chǎn)生輕微的抗藥性。

這些觀察沒(méi)有涵蓋所有影響雙香豆素作用的情況，但是他們覆蓋了最基本的要點(diǎn)。最后還要感謝多倫多Best博士團(tuán)隊(duì)，威斯康星綜合醫(yī)院的Dale、Jaques、Meyer，以及確定在血液中血栓形成和凝血機(jī)理之間存在最基本關(guān)系的其他所有人。這些研究首次明確了雙香豆素可以有效降低血管外和血管內(nèi)的血栓形成，同時(shí)減少低凝狀態(tài)。

打破慣性思維模式

當(dāng)我們?cè)?940年至1942年將雙香豆素提交給臨床醫(yī)生時(shí)，我們團(tuán)隊(duì)建立的一個(gè)顯著的要點(diǎn)在一開始就錯(cuò)過(guò)了，事實(shí)上是被拒的。我已經(jīng)提到首要因素是維生素K能夠抵消雙香豆素的功能。我在信件、私人談話、Mayo診所和威斯星康綜合醫(yī)院第一次關(guān)于雙香豆素的授課中都強(qiáng)調(diào)這一點(diǎn)。盡管如此，在第一次臨床報(bào)告中支持的觀點(diǎn)卻是“維生素K作為雙香豆素的解藥是沒(méi)有效果的。”這些藥學(xué)雜志的編輯和注釋作者們僅僅靠“想”而“不嘗試”來(lái)天真的重申這些觀點(diǎn)。作為凝血方面的權(quán)威，一位臨床醫(yī)生在1942年出版的書中這樣錯(cuò)誤的陳述“雙香豆素耗盡凝血酶原濃縮物時(shí)，維生素K并不能將其修復(fù)。”

最初這些否認(rèn)令我非常不開心。不幸被指控錯(cuò)誤并非不開心的主要原因，因?yàn)槲覀兇_信維生素K的解毒功能將在臨床上適時(shí)地獲得支撐。真正困擾我的是雙香豆素被貼上污名：這是一種危險(xiǎn)的藥！而這已經(jīng)發(fā)生了?？茖W(xué)的特性已經(jīng)向我呼吁“真理必勝。”Shepard Shapiro醫(yī)生是一名紐約一線臨床醫(yī)生，1942年2月支持了我們的斷言：當(dāng)肝功能正常時(shí)，維生素K在人體內(nèi)能抵消雙香豆素的抗凝作用?，F(xiàn)在人們普遍接受水溶性維生素K或口服維生素K1能對(duì)雙香豆素過(guò)量有解毒效果。

首先讓我們調(diào)查為什么會(huì)引發(fā)這種錯(cuò)誤。Campbell開發(fā)的用于我們實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物具有較好的敏感性，而臨床醫(yī)生并沒(méi)有使用這種動(dòng)物來(lái)作為1-階法凝血評(píng)估。他們僅在阻塞性黃疸、膽瘺、膽血癥等病癥中用維生素K作為初級(jí)治療，也認(rèn)為甲萘醌形式的維生素K可能具有毒性。而從臨床實(shí)踐中徹底消除這種錯(cuò)誤觀點(diǎn)需要十年時(shí)間。

綜上所述，猜測(cè)和錯(cuò)誤的思維阻止維生素K成為雙香豆素療法的角石。

熱情—困惑—合并

在成功合成雙香豆素之后的兩年內(nèi)，我們實(shí)驗(yàn)室制備了超過(guò)100個(gè)相關(guān)的3-位取代4-羥基香豆素衍生物，合成步伐大幅領(lǐng)先于生化評(píng)估。因此，1944年1月我在Harvey Society上演講“來(lái)自變質(zhì)甜三葉草干草的抗凝劑 ”中表明：“用兔子評(píng)估相關(guān)的活性并不能有效的推斷出雙香豆素就是臨床應(yīng)用中最適合的化合物”，“在對(duì)許多化合物的評(píng)估測(cè)試過(guò)程中得知，其中一些化合物顯示了緩慢但更持久的低凝血酶原血功能，而另一些化合物的低凝血酶原血功能持續(xù)時(shí)間較短。在做出最終判斷之前我們需要花更多時(shí)間繼續(xù)這個(gè)項(xiàng)目，從實(shí)驗(yàn)獲得的藥學(xué)試劑，需要在各式各樣的情況下在人體內(nèi)進(jìn)行最終檢測(cè)低凝血酶原血功能。結(jié)果可能變化莫測(cè)，因此，正如我們所看到的，在這個(gè)領(lǐng)域的研究，我們應(yīng)該現(xiàn)在開啟而不是結(jié)束。”

作為一名農(nóng)業(yè)家，我完全沒(méi)有信心預(yù)測(cè)。在1941年至1944年間大約有50篇報(bào)導(dǎo)臨床上使用雙香豆素。任何一種新藥的產(chǎn)生都會(huì)出現(xiàn)一種有趣的周期事件，而雙香豆素快速地通過(guò)這個(gè)周期。第一階段報(bào)導(dǎo)表明開始流行一種樂(lè)觀的氛圍，他們?cè)贚ancet (1941年9月13日)發(fā)表題名為“肝素和它的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手(Heparin and a Rival)”的社論評(píng)述。然后進(jìn)入第二階段 — 困惑期，對(duì)使用雙香豆素作為抗凝劑治療分成了兩派 — 狂熱者和疑論者，一些疑論者毫無(wú)理由地譴責(zé)這個(gè)藥，盡管他們提供了大量的猜測(cè)、錯(cuò)誤、無(wú)凝血酶原凝血時(shí)間測(cè)定等進(jìn)行譴責(zé)。然后第三階段 — 合并，最終得出結(jié)論：需要發(fā)現(xiàn)一個(gè)比雙香豆素類型更好的抗凝血?jiǎng)?/p>

1945年9月初，我厭煩了實(shí)驗(yàn)室的工作，與我的家人一起進(jìn)行了一次皮劃艇旅游。在這次旅途中，我們?cè)庥隽艘淮卫滟谋┯?，我被大雨浸透，整個(gè)人筋疲力盡。兩周之后，我得了胸膜炎。最初我的醫(yī)生認(rèn)為我得的是肺炎，然后我告訴他之前得過(guò)肺結(jié)核，這樣診斷就變成了復(fù)燃性肺結(jié)核。我在威斯康星綜合醫(yī)院住了兩個(gè)月，然后轉(zhuǎn)院到Lakeview療養(yǎng)院。在那里我無(wú)所事事，我的身體整整休息了6個(gè)月，每天吃魚肝油和三瓶啤酒，然而這些并沒(méi)有讓我變得更強(qiáng)壯，反而得了老年肺結(jié)核。期間我研究實(shí)驗(yàn)紀(jì)錄，心不在蔫的時(shí)候就閱讀從古至今鼠害防治的歷史。

香豆素家庭中的Janus(古羅馬的兩面神)

我建議將臨床上無(wú)用的“奶牛毒藥”轉(zhuǎn)換成“滅鼠藥”，通過(guò)口服途徑比較理想。在1940年到1944年，基于他們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，已經(jīng)合成許多香豆素類化合物。而我在療養(yǎng)院的1945年-1946年期間，實(shí)驗(yàn)室的工作幾乎處于停頓狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)室只有極少數(shù)學(xué)生，因?yàn)榇蟛糠侄即粼谲婈?duì)里。因而我有足夠的時(shí)間對(duì)所有的化學(xué)和生物鑒定數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)審。直至1946年春天L.D.Scheel服役回來(lái)，我將重新評(píng)估化合物40-65抗凝性的任務(wù)指派給他。這些化合物是Ikawa在1942-1943年間制備的。Scheel不僅用兔子進(jìn)行生物鑒定，同時(shí)也用大鼠、小鼠和狗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在1946-1948年期間，他對(duì)香豆素化合物42和63進(jìn)行定義，明確對(duì)小鼠和狗進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)比雙香豆素效果好，能產(chǎn)生更多統(tǒng)一的抗凝劑響應(yīng)；同時(shí)還考慮了一些特定的化學(xué)性質(zhì)：可達(dá)到的純度、制備他們的成本、轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的水溶性鹽的性質(zhì)。

回到1940-1942年，Overman，F(xiàn)ield和我的同事C.A.Bauman，已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)小鼠上研究了雙香豆素各種作用，以及飲食影響，尤其是維生素K和食物的影響。1942年底，我在Schoeffel的幫助下，親自進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)，明確雙香豆素用于滅鼠作用的適用性，結(jié)論是雙香豆素還不足以用于鼠害防治。主要因?yàn)槌墒旃任锖途G色食品中富含維生素K。因?yàn)槭澄镏械木S生素K，一只小鼠每天攝取2mg雙香豆素還可以存活60天，如果在每日飲食中添加5mg維生素K，實(shí)驗(yàn)鼠可以存活超過(guò)60天。

1942年初我告訴Scheel和Dorothy WU，建議將化合物42用于滅鼠。這個(gè)建議讓整個(gè)實(shí)驗(yàn)室都感到震驚，我總結(jié)出他們一致的意見是“老板這次真的瘋了”。Scheel贊成用63號(hào)，他們化學(xué)性能相似，化合物63是42的直接衍生物。簡(jiǎn)言之，在1942年初，在威斯康星校友研究基金會(huì)(Wisconsin Alumni Research Foundation，WARF)能干、熱情并具有公益精神的總經(jīng)理Ward Ross贊助下，促使化合物42用于鼠害防治。很短時(shí)間內(nèi)，這種努力徹底改變了鼠害防治的藝術(shù)(多劑量)，華法林(Warfarin)快速成為滅鼠領(lǐng)域的佼佼者。Warfarin這個(gè)名字是我杜撰出來(lái)的，以威斯康星校友研究基金會(huì)首字母縮寫，再加上從香豆素(Coumarin)中提取“arin”—而現(xiàn)在它成為全世界家喻戶曉的單詞。

在1948-1952年間，對(duì)雙香豆素同族的研究在歐洲如火如荼進(jìn)行。“模仿是最懇切的形式。”其中的一個(gè)，雙香豆素的衍生物，商品名Tromexan，早在1940年我們確實(shí)沒(méi)有認(rèn)真考慮。盡管它比雙香豆素起效更快，但需要更大的劑量才能得到相同的抗凝作用。另一個(gè)商品名為Marcumar，與華法林非常接近的一個(gè)同族，也被我們略過(guò)了，因?yàn)槠溻c鹽的水溶性不及華法林鈉鹽。Marcumar比華法林效果更好，同時(shí)也更持久，但是鑒于臨床醫(yī)生正在尋求的大數(shù)據(jù)，我更看重的是，作為抗凝劑應(yīng)能被用于保留雙香豆素優(yōu)點(diǎn)的任何途徑，而非它的限制。

基于華法林對(duì)小鼠的響應(yīng)是一個(gè)非常可靠的指標(biāo)這一假定，那多少劑量對(duì)人體有響應(yīng)呢？1950年底我告訴S.Shapiro博士和O.O.Meyer博士，水溶性華法林鈉鹽可嘗試用于人類治療。臨床醫(yī)生會(huì)如何看待用滅鼠藥來(lái)進(jìn)行人體試驗(yàn)？在1941年臨床醫(yī)生已經(jīng)從我們這里逐字攫取了“奶牛毒藥”來(lái)定義華法林，轉(zhuǎn)換到最初的物質(zhì)，他們真正熱情接受的是用于滅鼠。然而在1950年4月5日，我們收到費(fèi)城J.Love海軍上校的通知，一名預(yù)備役士兵在海軍醫(yī)院承認(rèn)，他連續(xù)5天按照說(shuō)明書大劑量吃了這個(gè)用來(lái)滅鼠的華法林。很明顯對(duì)他來(lái)說(shuō)，華法林不足以讓他擺脫這個(gè)塵世羈絆。同時(shí)可能有太長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行思考 — 最終他去了醫(yī)院，經(jīng)過(guò)輸血和大劑量維生素K治療，這個(gè)預(yù)備役士兵順利康復(fù)了。

這一插曲擔(dān)當(dāng)了催化劑作用。Shapiro和Meyer博士從他們細(xì)致的工作中推斷出：華法林鈉鹽具備某一特性，這一特性在雙香豆素和他們研究的其他抗凝劑中不存在。在Collin Schroeder對(duì)華法林鈉鹽制備工藝進(jìn)行優(yōu)化后，商品名為Coumadin Sodium(香豆素鈉)，我說(shuō)服我的老朋友S.M.Gordon博士將其用于臨床使用。從得到的臨床報(bào)告中，華法林鈉克服了雙香豆素的缺點(diǎn)，其效果為雙香豆素的5-10倍。到目前為止，這是唯一可通過(guò)口服、靜脈、肌肉、直腸給藥的化學(xué)合成抗凝劑，其他雙香豆素類抗凝劑沒(méi)有上述這些優(yōu)點(diǎn)。一旦超量，可以用維生素K輕松糾正。在日常使用，華法林鈉比雙香豆素起效更快，同時(shí)需要更少的凝血時(shí)間，引用Shapiro和Meyer博士的話就是“在臨床上非常容易處理”?；谒诟鞣N情況下的表現(xiàn)出來(lái)的出眾性能，我確信華法林鈉將替代雙香豆素。

下面這個(gè)三角形能形象表現(xiàn)出維生素K—雙香豆素類藥凝血治療 — 臨床判斷的關(guān)系。維生素K、凝血評(píng)估和臨床判斷分別為三個(gè)點(diǎn)，每一個(gè)點(diǎn)都與其他一點(diǎn)連接。每一點(diǎn)都不是分隔的，而是與其他兩點(diǎn)緊密相關(guān)。盡管臨床判斷良好，凝血時(shí)間精確，維生素K這個(gè)點(diǎn)仍有可能會(huì)被誘發(fā)，因?yàn)槊恳粋€(gè)病人在本質(zhì)上都是“一個(gè)非標(biāo)準(zhǔn)生物實(shí)體”，醫(yī)療服務(wù)會(huì)產(chǎn)生劑量錯(cuò)誤，病人可能會(huì)有輕微潰瘍，或肝腎功能可能在不知不覺中成為半影。

1955年9月29日，我收到一張卡片，來(lái)自威斯康星州的一個(gè)前同事，現(xiàn)在丹佛的菲茲西蒙部隊(duì)醫(yī)院工作，卡片上寫著“總統(tǒng)(艾森豪威爾)正在使用你的一種藥，它不是雙香豆素。”第二天新聞發(fā)言人J.C.Hagerty宣布：“最初用于抗凝劑的肝素已經(jīng)被一種雙香豆類藥替代了，目前的凝血水平維持得非常好。”我了解Colonel Pollock的論文“華法林(香豆素鈉鹽)的臨床試驗(yàn)”，閱讀了1955年6月4日亞特蘭大美國(guó)血管學(xué)會(huì)第一次年會(huì)資料，我猜測(cè)這個(gè)世界上最重要的人正在用華法林鈉進(jìn)行抗凝治療。這一猜測(cè)被證實(shí)，華法林鈉正被總統(tǒng)使用成為一個(gè)公開的秘密。

在臨床上使用的華法林主要問(wèn)題是劑量和凝血時(shí)間，而凝血時(shí)間因促凝血酶原激酶的使用發(fā)生很大的變化。英國(guó)比美國(guó)使用的促凝血酶原激酶更敏感，發(fā)生的出血并發(fā)癥更少。后來(lái)人們意識(shí)到，如果從病人身上獲得的樣品和兩種不同促凝血酶原激酶獲得的凝血時(shí)間或速率，在重對(duì)數(shù)坐標(biāo)圖上互成一條直線?；谶@個(gè)事實(shí)，1982年世界衛(wèi)生組織(WHO)正式采用一種模型，將任何試劑凝血速率轉(zhuǎn)為國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)比率(INR)，也就是如果使用一種國(guó)際參比制劑(IRP)就能獲得凝血速率。如果國(guó)際參比制劑的凝血速率為y-軸，實(shí)驗(yàn)制劑的凝血速率為x-軸，其斜線即為國(guó)際敏感指數(shù)(ISI)。這個(gè)控制抗凝劑的系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)遍及全世界。

最后，我想說(shuō)的是在這過(guò)去幾十年，我的實(shí)驗(yàn)室獲得的成果是由許多學(xué)生共同努力的結(jié)果，記錄或敘述這次成功的冒險(xiǎn)非常有趣。用Allan Gregg的說(shuō)辭，我的學(xué)生表現(xiàn)得非常有“應(yīng)急能力”。我認(rèn)為他們成功的三大秘密：他們永遠(yuǎn)保持好奇心，他們會(huì)反復(fù)嘗試，他們進(jìn)行項(xiàng)目時(shí)指向讓人類變得更好，而不是試圖消滅它。

參考文獻(xiàn)：

1、Circulation. 1959 (19):97-107，The Discovery of Dicumarol and Its Sequels

2、British Journal of Haematologh，2008，141，757-763，The story of the discovery of heparin and warfarin